DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合助力揭示SmBBX22調(diào)控茄子花青素合成的分子機(jī)制

茄子作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其果實(shí)及器官富含花青素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和產(chǎn)業(yè)價(jià)值。B-box（BBX）轉(zhuǎn)錄因子是植物中廣泛存在的鋅指蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育（如開(kāi)花、光形態(tài)建成）、花青素合成及脅迫響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，已在擬南芥、番茄、蘋(píng)果等多種植物中得到深入研究，但茄子中BBX基因家族的系統(tǒng)鑒定、特征分析及功能機(jī)制研究仍較為匱乏。

2025年12月12日，上海交通大學(xué)陳火英教授團(tuán)隊(duì)在Horticultural Plant Journal（IF=6.2）期刊上發(fā)表了一篇題為“Genome-wide characterization of B-box gene family in eggplant and functional identification of SmBBX22 in modulating anthocyanin synthesis"的研究論文。該研究通過(guò)DAP-seq與RNA-seq技術(shù)聯(lián)合分析，成功鑒定出SmBBX22的下游靶基因，明確其通過(guò)調(diào)控苯丙烷類(lèi)和黃酮類(lèi)生物合成通路正向調(diào)控茄子花青素合成的分子機(jī)制，不僅填補(bǔ)茄子SmBBX基因家族調(diào)控機(jī)制的研究空白，更為作物品質(zhì)改良提供了關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq和RNA-seq技術(shù)支持。

研究結(jié)果

1. SmBBX基因家族全基因組特征

本研究通過(guò)全基因組分析，鑒定出茄子中33個(gè)SmBBX基因。系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為5個(gè)亞家族（I–V）。結(jié)構(gòu)分析顯示，所有SmBBX蛋白均含有1–2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域，部分還包含CCT結(jié)構(gòu)域和VP保守基序。研究發(fā)現(xiàn)，96.9%的SmBBX蛋白定位于細(xì)胞核；片段復(fù)制是該基因家族擴(kuò)張的主要機(jī)制，且與番茄BBX基因具有較高進(jìn)化保守性。

圖1. 擬南芥、茄子、水稻和番茄中BBX基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2. 保守結(jié)構(gòu)域（如B-box）內(nèi)氨基酸序列的比對(duì)

圖3. 茄子中潛在BBX家族基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基序、結(jié)構(gòu)域及基因結(jié)構(gòu)

圖4. 茄子中BBX基因的染色體分布

圖5. 擬南芥、番茄和茄子之間BBX基因的共線性關(guān)系

圖6. 潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中推定的miRNA與其靶向的SmBBXs之間的相互作用分析

2. SmBBX的組織表達(dá)模式

為了探究33個(gè)SmBBX基因在茄子不同發(fā)育階段的功能作用，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)RNA-seq分析，鑒定出不表達(dá)、組成型表達(dá)和組織特異性表達(dá)三種模式，其中3個(gè)基因全程不表達(dá)，8個(gè)基因在各組織/器官中組成型高表達(dá)（如Smechr0100178.1等），表明其在植物代謝、生長(zhǎng)和發(fā)育中具重要作用，14個(gè)基因呈組織特異性表達(dá)（如Smechr0303381.1在子葉、衰老葉等中高表達(dá)），且同一亞家族內(nèi)表達(dá)模式相似。同時(shí)，通過(guò)qRT-PCR分析了該基因家族在8小時(shí)脅迫處理下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)JA處理激活8個(gè)基因，ABA處理上調(diào)22個(gè)基因，低溫處理Smechr0202811.1上調(diào)>20 倍，NaCL處理上調(diào)22個(gè)基因，PEG處理上調(diào)20個(gè)基因，藍(lán)光處理Smechr1000119.1上調(diào)>60 倍，UV處理誘導(dǎo)28個(gè)基因且上調(diào)與下調(diào)基因數(shù)量相等。以上結(jié)果表明，SmBBX基因參與多種脅迫響應(yīng)，其在植物適應(yīng)和抗逆性中起關(guān)鍵作用。

圖7. SmBBXs在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

圖8. 基于qRT-PCR的SmBBX基因在不同處理（包括JA、ABA、4°C、NaCl、PEG、藍(lán)光和UV-B處理）下的表達(dá)模式分析

3.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

本研究借助STRING等工具預(yù)測(cè)了SmBBX蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)3個(gè)SmBBX蛋白在家族內(nèi)部存在相互作用（如Smechr0602096.1與Smechr0402438.1、Smechr0502383.1相互作用），且7個(gè)主要位于分支IV和V的SmBBX蛋白可與SmHY5（光形態(tài)建成調(diào)控因子）、SmCOP1.1/1.2（負(fù)調(diào)控因子）等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子相互作用。隨后作者通過(guò)熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（LCI）驗(yàn)證，在煙草細(xì)胞中共表達(dá)nLUC-SmHY5與BBX19-2-cLUC、SmBBX21-2-cLUC、SmBBX22-cLUC及nLUC-COP1.1與BBX19-2-cLUC時(shí)，均產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光信號(hào)，證實(shí)了多個(gè)SmBBX蛋白與HY5、COP1的相互作用，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖9. SmBBX蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖10. SmBBXs在煙草葉片中與HY5和COP1相互作用

4.SmBBX22是花青素合成關(guān)鍵調(diào)控因子

先前的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，SmBBX19-2、SmBBX21-2和SmBBX22三個(gè)基因與花青素生物合成相關(guān)。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SmBBX21-2和SmBBX22可激活花青素合成關(guān)鍵基因SmCHS和SmDFR的表達(dá)，而SmBBX19-2無(wú)此激活作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證SmBBX22的功能，研究人員構(gòu)建了SmBBX22過(guò)表達(dá)株系，結(jié)果顯示該株系幼苗莖的紫色顯著加深，花青素含量提升6.5倍，且花青素合成關(guān)鍵基因（AtCHS、AtF3H、AtDFR、AtANS）表達(dá)均顯著上調(diào)，證實(shí)SmBBX22正向調(diào)控花青素合成。為闡明SmBBX22在茄子中的生理功能，研究團(tuán)隊(duì)以茄子‘LSHX’為遺傳背景構(gòu)建了SmBBX22過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)其愈傷組織紫色更深，花青素含量顯著增加，同時(shí)花青素合成結(jié)構(gòu)基因（SmCHI、SmF3H、SmDFR、SmANS）表達(dá)明顯上調(diào)，表明SmBBX22在調(diào)控茄子花青素生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)轉(zhuǎn)基因茄子愈傷組織進(jìn)行RNA-seq分析，共鑒定出2070個(gè)差異表達(dá)基因；富集分析顯示，這些差異表達(dá)基因主要參與次生代謝、苯丙烷類(lèi)生物合成等通路，其中光調(diào)控花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因（如SmF3'5'H）和轉(zhuǎn)錄因子（如SmTT8、SmHY5）表達(dá)顯著上調(diào)。以上結(jié)果共同證實(shí)，SmBBX22是茄子花青素生物合成的關(guān)鍵調(diào)控因子。

圖11. 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析

圖12. 茄子愈傷組織中SmBBX22過(guò)表達(dá)的表型及結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平分析

5.解析SmBBX22的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為解析SmBBX22的調(diào)控機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)DAP-seq分析，共鑒定出27982個(gè)高置信度的SmBBX22結(jié)合區(qū)域，這些區(qū)域集中分布在基因啟動(dòng)子附近；對(duì)應(yīng)3915個(gè)啟動(dòng)子被結(jié)合的靶基因，且這些靶基因顯著富集于苯丙烷類(lèi)生物合成、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和黃酮類(lèi)化合物生物合成等關(guān)鍵通路，同時(shí)還揭示了保守的SmBBX22結(jié)合基序。作者進(jìn)一步將DAP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，篩選出355個(gè)共調(diào)控基因，涵蓋花青素合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因（如F3'5'H、UF3GT）、激素信號(hào)組件（如YUCCA4、PYL2）及轉(zhuǎn)錄因子（如MYB、bHLH家族成員），明確了SmBBX22直接調(diào)控的下游基因網(wǎng)絡(luò)。

圖13. SmBBX22靶基因的鑒定

小結(jié)

本研究鑒定了茄子33個(gè)SmBBX基因并分為5個(gè)系統(tǒng)發(fā)育組，明確其脅迫響應(yīng)特征與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；證實(shí)SmBBX22通過(guò)上調(diào)花青素合成相關(guān)基因、調(diào)控苯丙烷類(lèi)/類(lèi)黃酮生物合成通路，正向調(diào)控茄子花青素積累，為解析BBX基因功能及茄子品質(zhì)改良提供了關(guān)鍵依據(jù)。